檢驗員培訓(xùn)教程系列3
第三部分 儀器分析法 第一章 紫外分光光度法 一、原理 可見光、紫外線照射某些物質(zhì)，主要是由于物質(zhì)分子中價電子能級躍遷對輻射的吸收， 而產(chǎn)生化合物的可見紫外吸收光譜?；谖镔|(zhì)對光的選擇性吸收的特性而建立分光光度 法或稱吸收光譜法的分析方法。它是以朗伯──比耳定律為基礎(chǔ)。 1 朗伯—比耳定律 A = lg—- = ECL T 式中 A為吸收度； T為透光率； E為吸收系數(shù)，采用的表示方法是（E），其物理意義為當(dāng)溶液濃度為1%（g/ml），液層 厚度為1cm時的吸收度數(shù)值； C為100ml溶液中所含被測物質(zhì)的重量（按干燥品或無水物計算），g； L為液層厚度，cm。 二、使用范圍 凡具有芳香環(huán)或共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機化合物，根據(jù)在特定吸收波長處所測得的吸收度， 可用于藥品的鑒別、純度檢查及含量測定。 三、儀器 可見- 紫外分光光度計。其應(yīng)用波長范圍為200～400nm的紫外光區(qū)、400～850nm的可見光區(qū)。 主要由輻射源（光源）、色散系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、吸收池、數(shù)據(jù)處理機、自動記錄器及顯 示器等部件組成。 本儀器是根據(jù)相對測量的原理工作的，即先選定某一溶劑（或空氣、試樣）作為標(biāo)準(zhǔn) （空白或稱參比）溶液，并認(rèn)為它的透光率為100％（或吸收度為0），而被測的試樣透 光率（或吸收度）是相對于標(biāo)準(zhǔn)溶液而言，實際上就是由出射狹縫射出的單色光，分別 通過被測試樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液，這兩個光能量之比值，就是在一定波長下對于被測試樣的透 光率（或吸收度）。 本儀器可精密測定具有芳香環(huán)或共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機化合物、有色物質(zhì)或在適當(dāng)條件 下能與某些試劑作用生成有色物的物質(zhì)。 使用前應(yīng)校正測定波長并按儀器說明書進行操作。 四、儀器的校正 1.波長的準(zhǔn)確度試驗 以儀器顯示的波長數(shù)值與單色光的實際波長值之間誤差表示，應(yīng)在±1.0nm范圍內(nèi)。 可用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進行校正。 2.吸收度的準(zhǔn)確度試驗 3.雜散光的試驗 4.波長重現(xiàn)性試驗 5.分辨率試驗 五、測定方法 1.對照品比較法 （1）按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測 成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分標(biāo)示量的100±10%，所用溶劑也應(yīng)完全一致，在規(guī)定 的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸收度后，按下式計算含量，即得。 （2）計算式 A樣×G對/稀釋倍數(shù)×100×1 含量（%）= ————————————-- ×100% A對×G樣/稀釋倍數(shù)×100×1 2.吸收系數(shù)法 （1）按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸收度，再以該品種 在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算含量。用本法測定時，應(yīng)注意儀器的校正和檢定。 （2）計算式 A樣 含量（%）= ——————————————- ×100% G樣/稀釋倍數(shù)×(E)對×100×1 3.計算分光光度法 采用計算分光光度法應(yīng)慎重。本法有多種，使用時均應(yīng)按各品種項下規(guī)定的方法進行。 當(dāng)吸收度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結(jié) 果造成顯著影響，故對照品和供試品測試條件應(yīng)盡可能一致。若測定時不用對照品，如 維生素A測定法，則應(yīng)在測定時對儀器作仔細(xì)的校正和檢定。 六、注意事項 1.空白溶液與供試品溶液必須澄清，不得有渾濁。如有渾濁，應(yīng)預(yù)先過濾，并棄去初濾 液。 2.測定時，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同瓶溶劑為空白對照，采用1cm的石英 吸收池。 3.在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內(nèi)測試幾個點的吸收度，以核對供試品的吸收峰波長位置 是否正確，除另有規(guī)定外，吸收峰波長應(yīng)在該品種項下規(guī)定的波長±2nm以內(nèi)；否則應(yīng)考 慮該試樣的真?zhèn)?、純度以及儀器波長的準(zhǔn)確度，并以吸收度最大的波長作為測定波長。 4.一般供試品溶液的吸收度讀數(shù)，以在0.3～0.7之間的誤差較小。 5.吸收池應(yīng)選擇配對，否則要引入測定誤差。在規(guī)定波長下兩個吸收池的透光率相差小 于0.5％的吸收池作配對，在必要的情況時，須在最終測量扣除吸收池間的誤差修正值。 6.由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù) ，再計算含量。 7.儀器的接地必須良好，一切裸露的零件對地電位不得超過24伏（測電筆的氖管不得發(fā) 亮）。 8.在使用過程中，如需開啟試樣室蓋時或暫時停止測試時，必須及時推入光門鈕桿（使 光電管前光門關(guān)閉），保護光電管，以防止光電管受強光或長時間照射而損壞。 9.在測定時或改測其它檢品時，應(yīng)用待測溶液沖洗吸收池3～4次，用干凈綢布或擦鏡紙 擦凈吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨損）。 10.取吸收池時，應(yīng)拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及時 用測定溶劑沖凈，再用純化水沖凈，用干凈綢布或擦鏡紙擦干，晾干后，放入吸收池盒 中，防塵保存。 11.若吸收池內(nèi)外壁沾污，兩池差較大的處理。 （1）可用綢布纏在扁竹條外或用脫脂棉纏在細(xì)玻璃棒上蘸上乙醇，輕輕摩擦，再用純化 水沖凈。 （2）如上述方法處理不好，必要時可用重鉻酸鉀- 硫酸洗液泡洗1～2分鐘，用自來水沖凈，再用純化水沖凈。 （3）不得用毛刷刷洗或硬物拭擦，以防止表面光潔度受損影響正常使用。 12.請務(wù)必注意經(jīng)常保持硅膠的干燥，目的是保護光學(xué)元件和光電放大器系統(tǒng)不致受潮損 壞而影響儀器的正常工作，如發(fā)現(xiàn)有的硅膠由藍色變?yōu)榉奂t色，應(yīng)立即更換。該儀器干 燥劑筒有兩個：一個是裝在放大器暗盒上，另一個裝在單色光器暗盒上。 13.在更換硅膠干燥劑時，應(yīng)關(guān)閉切斷電源。 14.在停止工作期間，主機試樣室內(nèi)應(yīng)放入袋裝或筒裝硅膠干燥劑。用防塵罩罩住整個儀 器，并在防塵罩內(nèi)放數(shù)袋防潮硅膠。 15.儀器在操作中，狹縫的寬度應(yīng)從小逐漸開大。若狹縫過大，由于進入光電管的光能量 強度過大，將會使放大器輸出信號達到飽和，以至數(shù)字顯示出溢出（即數(shù)字閃爍或示1不 變）。這不是儀器有故障。 16.將波長旋轉(zhuǎn)放在625nm，鋏縫關(guān)閉在0.02nm附近，選擇按鍵恢復(fù)在停止工作部位（即 三個鍵均彈出）。 17.搬動儀器時應(yīng)搬在主體端，不要搬在試樣室和光電管盒端以及光源燈室部位，以防止 儀器狹縫或光路部件受力而發(fā)生變形。并在搬動或運輸時，應(yīng)將可動部分固定，如各旋 鈕可用膠布貼住，狹縫位置開大些，然后固定，不要關(guān)小狹縫，以免運輸時振動使狹縫 刀口受損壞。 18.儀器的光柵、反射鏡絕對不能擦拭，否則將損壞儀器光學(xué)表面，增加雜散光。 19.儀器經(jīng)過搬動請及時檢查并糾正波長精度，為保證測定的準(zhǔn)確性請經(jīng)常校準(zhǔn)波長精度 。如有異常，應(yīng)立即報告質(zhì)量保證部，但不得擅自調(diào)整，并及時做好記錄。 七、結(jié)果計算 A E（供試品） = —— CL E（供試品） 含量（%）= ——————————- ×100% E（標(biāo)準(zhǔn)值或?qū)φ掌罚?八、允許差 儀器分析方法的誤差限度，除另有規(guī)定外，其相對偏差應(yīng)在±(2.0～3.0)%。 第二章 比色法 一、原理及適用范圍 在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收，但可在一定條件下加入 顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后，根據(jù)顏色深淺與濃度成正比關(guān)系，則可用比色法測定 含量。 二、儀器 可見分光光度計（或比色計）其應(yīng)用波長范圍為400～850nm的可見光區(qū)。主要由輻射源 （光源）、色散系統(tǒng)（或濾光片）、檢測器系統(tǒng)、顯示系統(tǒng)、記錄器及吸收池等部件組 成。使用前應(yīng)校正測定波長并按儀器說明書進行操作。 三、儀器的校正 按照紫外分光光度法項下的有關(guān)規(guī)定及按儀器說明書要求進行校正。波長的準(zhǔn)確度應(yīng)在 ±3nm范圍內(nèi)。 四、測定方法 1.用比色法測定時，應(yīng)取對照品同時操作。除另有規(guī)定外，比色法所用的空白系指用同 體積的溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應(yīng)試劑，并用同樣方法處 理。在規(guī)定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸收度后，按紫外分光光度法項下“對照 品比較法”的計算式計算含量。 2.當(dāng)吸收度和濃度關(guān)系不呈線性時，應(yīng)取數(shù)份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一 體積，顯色后測定各份溶液的吸收度，然后以吸收度與相應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根 據(jù)供試品的吸收度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其含量。 三、注意事項 測定時，應(yīng)取對照品平行操作，使所用試劑用量、反應(yīng)溫度、酸堿度、反應(yīng)時間等完全 一致，對隨時間變化影響顯色的品種應(yīng)準(zhǔn)確控制讀數(shù)時間，操作時應(yīng)注意避光。 第三章 高效液相色譜法 一、原理 高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩 沖液等流動相，壓入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內(nèi)， 在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。 二、適用范圍 高效液相色譜法是一種分離分析方法，適用于揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分 子化合物以及離子型化合物等的定性、定量分析。中國藥典主要用于藥品的含量測定、 有關(guān)物質(zhì)檢查、雜質(zhì)限度檢查和鑒別等。 三、儀器 高效液相色譜儀主要由輸液泵系統(tǒng)、進樣器系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、記錄器、顯示器及 數(shù)據(jù)處理機（或兼有組分收集系統(tǒng)）等組成。使用時應(yīng)按儀器的說明書進行操作。 四、儀器的校正 1.高效液相色譜儀的柱箱控溫精度、基線噪聲、基線漂移、靈敏度或檢測限、線性范圍 的檢定均按儀器說明書的技術(shù)要求進行校驗，應(yīng)符合規(guī)定。 2.以紫外- 可見光檢測器、熒光檢測器、差示折光檢測器為檢測器的實驗室通用液相色譜儀的檢定 ，所用各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)使用經(jīng)國家技術(shù)監(jiān)督部門批準(zhǔn)頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。具體校正方法和 主要技術(shù)指標(biāo)見“高效液相色譜儀檢測器的校驗”。 3.泵的耐壓試驗 4.泵流量設(shè)定值誤差、流量穩(wěn)定性誤差的試驗 5.柱恒溫箱溫度設(shè)定值誤差和控溫穩(wěn)定性誤差的試驗 6.梯度準(zhǔn)確度的試驗 7.定性定量重現(xiàn)性的試驗 五、對儀器的一般要求 1.色譜柱的填充劑和流動相的組分應(yīng)按各品種項下的規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠 （正相色譜）和化學(xué)鍵合硅膠，后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠（反相色譜）最為常用， 辛基硅烷鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。離子交換填充劑用于離子交換 色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑用于分子排阻色譜等。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢 測器為紫外吸收檢測器。 2.藥典正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意 改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相 各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并 達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。 3.一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。 六、系統(tǒng)適用性試驗 按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調(diào)整， 應(yīng)達到規(guī)定的要求，或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾 因子。 1.色譜柱的理論板數(shù)（n） n = 5.54(tR/Wh/2)2 式中 tR為保留時間（以分鐘或長度計，下同，但應(yīng)取相同單位）； Wh/2為半峰高寬。 2.分離度（R） 除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5。 2(tR2－tR1) R = ————- W1＋W2 式中 tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間； tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 3.重復(fù)性 取各品種項下的對照溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏 差應(yīng)不大于2.0%。也可按各品種校正因子測定項下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對照 品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進樣3次，計算平均校 正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.0%。 4.拖尾因子（T） 除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95～1.05之間。 W0.05h T = ——- 2d1 式中 W0.05h為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 七、測定法 定量測定時，可根據(jù)供試品的具體情況采用峰面積法或峰高法。測定雜質(zhì)含量時，須采 用峰面積法。 （一）內(nèi)標(biāo)法 加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量 1.按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取 各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入液相色譜儀，記錄色譜圖。測 量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子： AS/CS 校正因子（f）= ——- AR/CR 式中 AS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高； AR為對照品的峰面積或峰高； CS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度； CR為對照品的濃度。 再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測量供試 品中待測成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量： AX 含量（CX）= f·——- AS/CS CX×稀釋倍數(shù) 含量（%）= ———————— ×100% GX×(1－干燥失重) 式中 AX為供試品（或其雜質(zhì)）的峰面積或峰高； CX為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度； GX為供試品的稱樣量。 當(dāng)配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液...
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